基因編輯策略

百奧賽圖專業的技術團隊和銷售人員幫助研究人員獲得實驗需要的動物模型。

定制模型的基因編輯策略包括:

全基因敲除

條件性基因敲除

基因敲進

條件性基因敲進

Cre(ERT2)敲進

點突變

標簽和報告基因敲進

Rosa26位點敲進

Tol2轉基因

注:與ESC/HR技術相比,利用基于CRISPR/Cas9的EGETM技術構建的動物模型,通常不需要篩選標記。以下策略中,含有抗性標記的是基于傳統的ESC/HR技術的設計方案,不含有抗性標記的是基于EGETM的設計圖示。

全基因敲除模型

在全基因敲除(KO)小鼠模型中,靶基因的外顯子被全基因刪除(EGE?方法)或用陽性篩選標記(大多數情況下是新霉素)替換(ESC/HR),從而使基因表達失活。在全身的KO小鼠中,每一個組織中的目的基因都被敲除。

條件性敲除模型

通過Cre-LoxP/Flp-Frt重組酶系統建立條件性敲除(cKO)模型,在敲除的目的片段兩側插入LoxP(或Frt)序列。將Flox小鼠和含有組織特異性的Cre或Flp鼠交配, LoxP位點之間的序列將以組織特異性方式從后代基因組中移除。LoxP位點通常插入到含有ATG的外顯子下游的內含子中,敲除后通過移碼突變達到基因敲除目的,從而干擾蛋白質的表達。

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基因敲進模型

全基因敲進小鼠模型將突變或外源DNA序列插入小鼠基因組中的特定位點。此模型可以在引入突變時模擬遺傳性疾病,或者利用各種蛋白質(如EGFP、mRFP、mCherry、YFP、LacZ和Flag等)標記來監測基因表達。

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條件性敲進模型

 條件敲進小鼠模型含有flox(或條件)等位基因,與表達Cre的小鼠雜交,可以讓任何外源基因在組織內特異性表達。

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Cre(ERT2)誘導小鼠模型

Cre重組酶介導loxP位點之間DNA片段的組織特異性缺失。因此,利用驅動Cre表達的啟動子,Cre小鼠模型可以實現組織特異性基因敲除。ERT2序列是雌激素受體靶向性基因,其核轉運和活性受Tamoxifen控制。因此,Tamoxifen給藥能夠對Cre活性和基因缺失進行誘導發生和時間調控。

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點突變模型

常規點突變

常規的點突變小鼠屬于基因敲進模型,其中小鼠基因組中的一個或多個核苷酸被突變核苷酸替代,可能導致蛋白質序列的氨基酸變化或發生移碼突變。點突變小鼠模型廣泛應用于蛋白質中特定核苷酸或氨基酸的作用,以及人類遺傳疾病模型的研究。

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條件性點突變

條件點突變小鼠模型可以滿足在特定條件下引入點突變。在下面的設計策略中,當存在Cre重組酶時,點突變位點通過Cre活性特異地引入到小鼠特定組織的基因組中。下面有兩個主要的設計策略:

雙LoxP(Flex)條件點突變敲入

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mini基因的條件點突變敲入

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報告基因敲進模型

EGFP、YFP、LacZ、Flag、mCherry等序列標記的基因可用于監測基因表達。報告基因小鼠模型用來構建用于細胞發育研究的系統發育譜。在同一小鼠模型中,用報告基因替換內源性基因可以同時實現基因敲除和基因敲入。

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Rosa26位點敲進模型

傳統的轉基因小鼠一般通過利用質粒進行受精卵原核注射的方式來制備,通常會得到多個品系(Founders)。不同品系由于質粒在染色體上的整合位點不同、拷貝數不同,不同品系之間不容易得到一致的結果。目前,大多數研究者利用位點特異性整合策略構建基因編輯小鼠模型。Rosa26是最常用的“安全位點”,它在幾乎所有組織中編碼表達非必需核RNA。將LoxP-STOP-LoxP序列插入Rosa26位點的外源序列上游,并與Cre小鼠雜交,將產生外源基因的條件性表達。還有一些其他的安全位點,如H11,TIGRE等。

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Tol2轉基因模型

Tol2小鼠模型利用Tol2轉座酶活性制備轉基因小鼠。Tol2轉座子系統不僅可以提高基因整合率,而且無位點特異性,無堿基傾向性。

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