CRISPR質粒構建

CRISPR / Cas9技術成功進行基因編輯的關鍵步驟包括sgRNA的設計和構建,sgRNA決定了打靶的特異性。百奧賽圖專業的技術團隊精心設計和檢測sgRNA,確保高特異性和高活性的進入下一步實驗。

 

服務說明

sgRNA靶向物種sgRNA啟動子質粒篩選標記b交付內容交付條件c可選服務d交貨時間
大鼠,小鼠,人類,靈長類動物和其他哺乳動物aU6

T7

PuroR

PuroR

質粒

測序結果

質量報告

總量> 5μg

濃度> 50 ng /μL

酶切驗證

Sanger測序

sgRNA效率測定10個工作日

  1. 大小鼠外其他物種的基因靶向sgRNA設計請聯系我們。

  2. 如需其他抗性基因和熒光報告基因標記可按照要求提供,請咨詢我們。

  3. 可根據要求提供不同數量的質粒??商峁o內毒素的maxiprep質粒。

  4. 我們提供如上所述體外sgRNA分析服務。

服務程序

1.確認sgRNA靶向基因

2.設計sgRNA并與客戶確認

3.構建和檢測質粒

4.運輸質粒和質量報告

CRISPR活性測定

設計sgRNA后,非常關鍵的一步是快速準確地選擇高活性sgRNA 百奧賽圖開發了UCA檢測方法[1],能夠在體外高靈敏、便捷、快速測定sgRNA活性。UCA檢測方法兼具高通量特點。 UCA檢測方法基于單鏈退火(SSA)機制[1](圖1)。


技術-UCA方法

 

圖1.使用SSA機制確定CRISPR / Cas9活性的示意圖。

將CRISPR / Cas9真核表達質粒(表達Cas9和sgRNA)和pUCA質粒共轉染到細胞中后,Cas9-sgRNA復合物將結合并切割對應于pUCA質粒上sgRNA的靶位點。觸發SSA的DNA修復機制,當螢光素酶(er)的同源互補序列形成螢光素酶的完整編碼序列時,該基因將被表達。螢光素酶活性表示sgRNA活性值;熒光素酶信號越高,表明sgRNA活性越高。

現在,許多sgRNA設計工具都具有預測sgRNA活性的功能。但預測結果和實際活性之間仍然存在很大差異。必須通過實驗驗證sgRNA活性,以確保后續實驗的成功率。

 我們的數據表明,UCA檢測方法能夠很好地預測sgRNA的體內活性,該方法已在高影響力期刊中引用[2,3]。通過百奧賽圖UCA系統檢驗的高活性sgRNA有助于CRISPR / Cas9基因編輯的成功。

服務優勢

1.高效,快速:從sgRNA設計到通過活性測定總計2周時間

2.靈敏,準確且接近體內活性

3.沒有物種限制

[1]. Mashiko, D, et al. “Feasibility for large-scale mouse mutagenesis by injecting CRISPR/Cas plasmid into zygotes. ” Development Growth & Differentiation 56.1(2014):122.

[2]. Wu M, Wei C, Lian Z, et al. Rosa26-targeted sheep gene knock-in via CRISPR-Cas9 system[J]. Scientific reports, 2016, 6.

[3]. Lin, Zhimiao, et al. “Stabilizing mutations of KLHL24 ubiquitin ligase cause loss of keratin 14 and human skin fragility.” Nature Genetics 48.12 (2016): 1508-1516.

供體質粒構建

百奧賽圖擁有10多年基因編輯課題經驗,開發了數千個小鼠,大鼠和細胞系項目??梢詷嫿ㄓ糜诨贓SC/EGE基因編輯的打靶載體和用于Tol2轉基因的載體,提供快速的質粒設計和構建服務。

服務說明

種屬可交付成果交貨條件可選服務

大鼠

小鼠

細胞系

質粒

測序結果

質量報告

總量> 5μg

濃度> 50 ng /μL

酶切驗證

Sanger測序

無內毒素的maxiprep質粒
原核注射及質粒抽提

服務流程

1. 確認目的基因,設計基因編輯策略;

2. 設計質粒序列,并與客戶確認;

3.構建和檢測質粒;

4.運輸質粒和質量報告

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